整形外科用ナノ構造ガラス - セラミックコーティング - 第3部


2.2接着強度とミクロ硬度

   コーティング との 間の引っ張り結合強度   基板   あった   測定された     従う   〜と   ASTM   C-633-79。     テスト   手順   できる   〜する   見つけた     我々の 以前の研究[ 32 ]。 5つのサンプル 独立して試験した   にとって     タイプ     コーティング   そして   その   結果   報告された   として   平均 ± SD

コーティングのミクロ硬度は、300gfの荷重を有する島津マイクロ硬度計(Shimadzu Co.、Japan)を用いて研磨したコーティング表面上で試験し、   a   読み込み中   時間     15 秒。     テスト、   コーティング   被験者     ファイ   研磨。   硬度     記録された     15   異なる   ポジション。  

  結果   提示される   として   平均 ±SD

 


表1. RT-PCR-HOB関連マーカーに使用されるプライマー。


遺伝子

シーケンス   5 '   -3 '

融点(℃)

ギャプド

F ACCCAGAAGACTGTGGATGG

60


R CAGTGAGCTTCCCGTTCAG


Runx-2

F ATGCTTCATTCGCCTCAC

60


R ACTGCTTGCAGCCTTAAAT


OPN

F TTCCAAGTAAGTCCAACGAAAG

60


R GTGACCAGTTCATCAGATTCAT


コラーゲンI型

F AGGGTCCCAACGAGATCGAGATCCG

60


R TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG


BSP

F ATGGCCTGTGCTTTCTCAATG

60


R GGATAAAAGTAGGCATGCTTG


 


2.3。 イオン放出および無細胞石灰化試験

     HTおよびSPコーティングのイオン放出挙動を測定するために、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび塩酸(HCl-トリス緩衝溶液)で緩衝した15mlの塩化ナトリウム溶液(pH7.4)中に7日間浸漬した。 浸漬後、緩衝溶液のpH値を測定し、誘導クーデッドプラズマ原子発光分光法(ICP-OES、Optima 3000 DV、USA)によりイオン濃度を試験した。

Caおよびリン(P)化合物の沈殿を誘導するコーティングの能力を、無細胞培地にコーティングを浸漬することによって評価した。 簡潔には、コーティングを70%エタノール溶液に一晩浸漬することによって滅菌し、次いでリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した後、培地に浸漬した。 コーティングサンプルを含む12ウェル培養プレートの各ウェルに培地3ミリリットルを加えた。 コーティングサンプルを37 、加湿5%CO 2雰囲気下で5時間インキュベートした後、超純水で洗浄し、乾燥させ、SEM観察のためにカーボンスパッタリングした。 石灰化後のコーティング表面上に形成された堆積物の化学組成を、SEM装置に取り付けられたエネルギー分散分光法(EDS)を用いて分析した。


2.4。 初代ヒト骨芽細胞の単離および培養

シドニー大学の人間倫理委員会によって廃棄されたヒト組織の使用が許可され、インフォームドコンセントが得られた。 初代ヒト骨芽細胞(HOB)は、以前に記載されているように、正常ヒト小柱骨から単離された[34]。 簡単に説明すると、骨を1mm 3に分け、PBSで数回洗浄し、PBS(pH 7.4)中、0.02%(w / v)トリプシン(Sigma-Aldrich、USA)で37℃で90分間消化した。 次いで、10%(v / v)の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS、Gibco Laboratories)、2mMのトリス-HCl、10mMのMgCl 2を補充した最小必須培地(a-MEM、Gibco Laboratories、USA)を含む完全培地で、 (Gibco Laboratories)、25mM Hepes緩衝液(Gibco Laboratories)、2mMピルビン酸ナトリウム、30mg / mlペニシリン、100mg / mlストレプトマイシン(Gibco Laboratories)および0.1mM L-アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩( Wako Pure Chemicals、Osaka、Japan)を用いて測定した。 細胞を37℃、5%CO 2の 雰囲気下で培養し 、培地を3日ごとにリフレッシュした。 コンフルエントになると、細胞を継代し、継代3の細胞を実験に使用した。



2.5。 細胞接着および形態学的観察

細胞が80〜90%のコンフルエントに達した後、TrypLE Express(Invitrogen)を用いてtryp sinin化し、続いて遠心分離し、完全培地に懸濁させて、3.4×10 4細胞/ mlの密度を有する細胞懸濁液を生成した。 次に、1mlの細胞懸濁液を、コーティング試料を含む24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加えた。 2時間、5時間および24時間培養した後、細胞を4% パラホルムアルデヒド溶液に固定し、PBS中の1%四酸化オスミウムを用いて1時間後固定し、次に漸変エタノール溶液70,90,95および100%)、最後にヘキサメチルジシリザン中で3分間乾燥した。 乾燥したコーティングサンプルを、SEM観察の前に金スパッタリングした。



2.6。 細胞増殖アッセイ

比色法であるCellTiter 96 Aqueous Assay(Promega、USA)を用いて生存細胞の数を決定した。 このアッセイは、テトラゾリウム化合物3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム)(MTS)と電子カップリング試薬(フェナジンメトサルフェート)を20:1の体積比で含む。前者の化合物は、細胞培養培地に可溶なホルマザン中で生存細胞により生体還元され得る。 したがって、490nmでのホルマザンの吸光度は、生存細胞の数に正比例する。 各タイプのコーティングの4つのサンプルを各時点について試験し、未コーティングのTi-6Al-4Vディスクを対照として使用した。 簡潔には、8.5×10 4細胞ml -1の細胞密度を有する1mlの細胞懸濁液を、コーティング試料を含む24ウェル培養プレートの各ウェルに添加した。 3および7日後、培地をPBS中のCellTiter 96水性アッセイの5倍希釈溶液であるMTS作業溶液700μlに置き換えた。 さらに4時間インキュベートした後、100mlの作用溶液を490nmのマイクロプレートリーダー(PathTech)を用いて吸光度を測定するために96ウェル細胞培養プレートに移した。


2.7。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

2×10 4細胞cm -2の細胞密度でHOBをコーティングサンプル上に播種し、1日 および7日間 培養した 各時点後、コーティングサンプル上で培養されたHOBおよびコーティングされていない Ti-6Al-4V ディスク の対照サンプルから Trizol(Sigma)を使用して製造業者の指示に従って 全RNAを単離した Omniscript RT Kit(Qiagen、USA)を製造元の指示に従って使用して、0.7μgの全RNAから第1鎖cDNAを合成した。 Runx-2、コラーゲンI型、オステオポンチン(OPN)および骨シアロタンパク質(BSP)についてのリアルタイムPCR(Rotor-Gene 6000、Corbett Life Science)およびその相対的遺伝子発現について、cDNAを分析したグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に標準化することによってレベルを得た。

選択した遺伝子に使用したプライマーを表1に示す。


2.8。 統計分析

データは4回の独立した実験から得られ、平均±sdとして表した。統計 解析のために、SPSS17.0プログラムを使用した。 すべてのデータの 均質性を決定するためにLeveneの検定を行い、均等 分散のデータに対してTukey HSDポストホック検定を使用した。そうでなければ、TamhaneのT2 post hocを採用した。

0.05未満のp値が有意と見なされた。



******つづく******